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本产品是用于一管式双链cDNA合成的试剂盒。cDNA第一链合成的原理是以Oligo dT为通用引物的、MMLV催化的逆转录反应。其原理如下：

cDNA第二链合成的原理是用RNase H使RNA-DNA杂合链中的RNA产生切口，再用E.coli DNA Polymerase I的切口平移活性进行RNA链取代合成cDNA第二链，其原理图如下：

• 即开即用，含有合成两条cDNA链的所有试剂，用户只需要提供mRNA。
  
• 一管式进行，第一链cDNA合成后不需要任何处理，直接进入第二链的合成。
  
• 所得双链cDNA可以直接用于后续的常规PCR、real-time PCR、cDNA文库构建、抑制性差减杂交等。
  
• 本试剂盒足够10次80μL体系的双链cDNA合成反应。
  
• 本产品只能用于科研。

• 在一个干净的塑料离心管中，按下表设置cDNA合成反应：
  

  成分	用量
  自备样品mRNA	4μL(0.5～2μg)
  cDNA第一链合成缓冲液(含Oligo dT引物和dNTP)	5μL
  70℃ 2分钟后室温放置2分钟，短暂离心。
  MMLV逆转录酶	1μL
  轻柔吹打混匀后42℃保温90分钟合成第一链cDNA。
  超纯水	48μL
  5×cDNA第二链合成缓冲液	16μL
  20×cDNA第二链合成酶混合液	4μL
  共80μL，吹打混匀后，短暂离心，16℃保温2小时。

  
  
• 如果需要将双链cDNA平末端化，则需加自备T4 DNA聚合酶2μL，轻柔吹打混匀后，16℃继续保温30分钟。然后进入下一步。如果不需要将cDNA平末端化，则直接进入下一步。
  
• 终止反应：如果后续实验(如电泳)不担心EDTA的影响，可以直接加入4μL 0.2M EDTA溶液终止反应，然后将样品放-20℃长期保存。如果后续实验（如PCR扩增）不担心cDNA的单双链状态，可以95℃保温10分钟终止反应。如果后续实验既受EDTA影响，又不能是单链DNA，则可以用PCR过柱纯化法纯化。
  
• 电泳5μL检测cDNA质量。如果cDNA在0.5～10Kb的范围内呈模糊一片，则cDNA合格。如果没看见cDNA或有其他异常，需查找原因后再继续。
  
• 所得cDNA可以直接用于后续的常规PCR、real-time PCR、cDNA文库构建、抑制性差减杂交等实验。